Reaktywne formy tlenu (ROS) zaburzają neowaskularyzację i regenerację perfuzji po niedokrwieniu kończyn u pacjentów z chorobą tętnic obwodowych (PAD). Cząsteczki wodoru H2 zawierają przeciwutleniacz, który został zgłoszony do neutralizacji ROS cytotoksycznego. W niniejszym badaniu sprawdziliśmy, czy H2 może stać się nową strategią terapeutyczną PAD.
Choroba tętnic obwodowych (PAD) jest spowodowana miażdżycową niedrożnością tętnic kończyn dolnych. PAD dotyka ponad 200 mln ludzi na całym świecie i naraża ich na ryzyko amputacji kończyny lub śmierci. Przepływ krwi, która może być dostarczana do tkanki, staje się zależny od stopnia neowaskularyzacji w niedokrwionej kończynie.
W takich mięśniach reaktywne formy tlenu (ROS) mają negatywny wpływ na niedokrwienie stymulowane angiogenezy i perfuzji odzyskiwania. Wykazano, że dostarczanie genów zmiataczy ROS poprawia odzyskiwanie perfuzji i zmniejsza utratę tkanki w eksperymentalnym modelu PAD.
Wodór cząsteczkowy jest w stanie zneutralizować wiele rodzajów ROS cytotoksycznych, a zatem działa jako przeciwutleniacz. Badania kliniczne wykazały, że terapia H2 poprawia wynik różnych chorób, w tym niedokrwienie mózgowe i cukrzycę. Jednak wpływ wodoru cząsteczkowego na PAD nie był sprawdzany. W niniejszym badaniu weryfikowano hipotezę, że terapia H2 może poprawić angiogenezę i odzyskiwanie perfuzji przez zobojętnienie ROS.
Jakie metody zastosowano w badaniu?
W niniejszym badaniu wykorzystano łącznie 36 samców myszy Balb/c. Po indukcji znieczulenia wykonano jednostronne podwiązanie tętnicy udowej i wycięcie po lewej stronie myszy. Natychmiast po zabiegu chirurgicznym dostarczono myszom wodę nasyconą wodorem (1,6 ppm lub 0,8 mM). Tę wodę zmieniano i przygotowywano codziennie, aby zapewnić odpowiedni poziom H2.
Przepływ perfuzji w kończynach niedokrwionych i przeciwstronnych nie niedokrwionych mierzono przy użyciu laserowego systemu obrazowania perfuzji Dopplera. Perfuzję wyrażono jako stosunek lewej (niedokrwionej) do prawej (nie niedokrwionej) tylnej kończyny i wykonano w 0, 7, 14 oraz 21 dniu po zabiegu.
W celu oceny tętnic aktynę mięśni gładkich α nakładano na mięsień odwodzący po stronie niedokrwiennej 21 dni po HLI. W sumie pięć mikroskopijnych pól zostało losowo wybranych i zliczonych w trzech skrawkach tkanek od każdego zwierzęcia. Dialdehyd malonowy (MDA) w homogenatach mysich niedokrwionych mięśni mierzono, stosując kwas tiobarbiturowy.
Bezwzględną ilość MDA odczytano z krzywej standardowej przygotowanej z seryjnych rozcieńczeń wzorca pierwotnego. Całkowity RNA wyizolowano i zastosowano do qPCR, którą przeprowadzono przy użyciu starterów/sond dla arginazy-1 (arg1), czynnika martwicy nowotworu (tnf) i 18S rRNA.
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) hodowano w standardowej pożywce do wzrostu komórek śródbłonka z 10-procentową płodową surowicą bydlęcą. Aby wygenerować makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM), kości udowe czterech 2-miesięcznych samców myszy Balb/c przepłukano sterylną pożywką Eagle’a.
Komórki wystawiono na niedotlenienie w warunkach głodu surowicy (HSS; naśladowanie niedokrwienia in vivo ) przez 12 godzin z nasyconą wodorem pożywką w celu oceny tworzenia się rurek. Stopień uformowania rurek określono, mierząc ich długość i liczbę pętli w każdym dołku przy powiększeniu 40-krotnym.
Wyniki badania
Woda nasycona wodorem poprawia odzyskiwanie perfuzji, angiogenezę i arteriogenezę w doświadczalnym PAD. Myszy Balb/c otrzymujące wodę nasyconą wodorem wykazywały poprawę odzyskiwania perfuzji po 14 i 21 dniach po HLI. Pojawiło u nich się mniej martwicy tkanek w porównaniu z myszami otrzymującymi wodę dehydrogenizowaną.
Dwie myszy w grupie z wodą nasyconą wodorem i 6 w grupie kontrolnej rozwinęły autoamputację w pierwszych 7 dni po HLI. Myszy otrzymujące wodę nasyconą wodorem miały wyższą gęstość kapilar w porównaniu z tymi otrzymującymi wodę dehydrogenizowaną 21 dni po HLI. W tym samym czasie myszy otrzymujące wodę nasyconą wodorem miały wyższą gęstość tętnic w mięśniu odwodzącym z niedokrwionej kończyny.
Woda nasycona wodorem obniża poziom MDA, zwiększa poziom cGMP i promuje polaryzację makrofagów typu M2 w niedokrwionych mięśniach. Dzień 7 po HLI został wybrany do zbadania zmian molekularnych, ponieważ, chociaż woda nasycona wodorem poprawiła długoterminowy wynik w doświadczalnym PAD, nie zmieniła powrotu perfuzji w tym punkcie czasowym.
Peroksydacja lipidów, ustalona przez pomiar MDA, jest szeroko stosowana do oceny bioaktywności ROS w tkankach. W niniejszym badaniu woda nasycona wodorem znacząco obniżyła poziomy MDA w niedokrwionym mięśniu 7 dni po HLI.
NO wywiera swoje działanie poprzez stymulację GC wrażliwych na NO w naczyniach krwionośnych, co prowadzi do zwiększonej produkcji wewnątrzkomórkowego przekaźnika cGMP. W niniejszym badaniu oceniano poziom cGMP. Był 2,8-krotnie większy w niedokrwionych kończynach tylnych z grupy wodoru nasyconego wodą w porównaniu do grupy kontrolnej. To dowód, że H2 zwiększa aktywność biologiczną NR mięśni niedokrwiennych.
Istnieją doniesienia, że makrofagi modulują arteriogenezę i angiogenezę, które są ważnymi procesami przebudowy naczyń po PAD. W niniejszym badaniu zmierzono arg1 i tnf jako odpowiednie markery makrofagów typu M2 i M1. W mięśniu niedokrwionym z doświadczalnego PAD woda nasycona wodorem istotnie zwiększała poziomy ekspresji mRNA arg-1 i obniżyła ekspresję mRNA tnf.
Woda nasycona wodorem obniża poziom ROS i zwiększa poziom cGMP oraz angiogenezy w komórkach śródbłonka, a także promuje polaryzację makrofagów typu M2 in vitro.
W hodowanych komórkach śródbłonka w warunkach HSS pożywka nasycona wodorem spowodowała znaczny wzrost tworzenia rurek, na co wskazuje zwiększona długość rurki i liczba pętli. W porównaniu z warunkami normoksycznymi poziomy ROS były podwyższone, na co wskazuje test DCFH-DA. Jednak podłoże nasycone wodorem znacznie obniżyło poziomy ROS w HUVECs. Poziomy cGMP wykryto w hodowanych lizatach komórek śródbłonka, a pożywka nasycona wodorem zwiększała poziomy cGMP.
Zgodnie z ustaleniami dotyczącymi komórek śródbłonka, HSS zwiększył poziom ROS w hodowanych BMDM. Woda nasycona H2 istotnie obniżyła poziom ROS w BMDM 1–6 godzin po ekspozycji na HSS. To doprowadziło do zwiększenia poziomu ekspresji markera makrofagowego podobnego do M2 ( arg1 ) i zmniejszenia poziomu ekspresji markera makrofagowego podobnego do M1 ( tnf ). Te odkrycia są zgodne z naszymi odkryciami in vivo dotyczącymi niedokrwionego mięśnia myszy.
Wnioski z badania
Według naszej wiedzy jest to pierwsze badanie w celu wykazania, że H2 poprawia angiogenezę, perfuzję i arteriogenezę w PAD eksperymentalnej. Uznano, że woda nasycona wodorem cząsteczkowym jest wystarczająca do neutralizacji ROS w niedokrwionej tkance mięśniowej hodowanych komórkach śródbłonka i makrofagach w symulowanym niedokrwieniu, a następnie zwiększa NO bioaktywność i sprzyja M2 makrofagów.
Najważniejszym odkryciem niniejszego badania jest to, że wodór cząsteczkowy poprawia odzyskiwanie perfuzji, angiogenezę i arteriogenezę po PAD. Obecnie nie jest znana terapia farmaceutyczna, która byłaby w stanie poprawić perfuzję krwi w niedokrwionych kończynach pacjentów z PAD.
Inhalacja gazowego wodoru lub woda nasycona wodorem są szeroko stosowane w różnych stanach klinicznych, w tym w udarach, a ich skuteczność i bezpieczeństwo u pacjentów wykazano w wielu badaniach. W naszym przypadku badanie wykazało, że doustne podawanie H2 jest skuteczne w leczeniu PAD i do tego jest wygodną metodą do użytku klinicznego.
Wyniki niniejszego badania pokazują, że można już rozpocząć badanie kliniczne H2 u pacjentów z PAD.
Kolejnym ważnym wnioskiem z niniejszego badania jest to, że woda nasycona wodorem zwiększa biodostępność NO w niedokrwiennej tkanki mięśnia, co wskazuje wyższy poziom cGMP w mięśniach z niedokrwieniem, które były leczone H2. Neowaskularyzacja to fizjologiczny proces naprawy, który głównie zależy od NO – bioaktywnego gazu, który indukuje wiele ścieżek w celu promowania angiogenezy i naprawy tkanek. Jednak NO nie jest stabilny i może zostać przekształcony w nadtlenoazotyn w obecności ROS.
W przeciwieństwie do NO peroxynitrite nie promuje angiogenezy. Wiadomo, że H2 neutralizuje najbardziej cytotoksyczne ROS, w tym ·OH i ONOO-. W niniejszym badaniu cząsteczkowy wodór zmniejszył stężenia MDA w mięśniu niedokrwienia i poziom ROS w komórkach śródbłonka oraz makrofagów. Wyniki te wskazują, że H2 zmniejsza poziom ROS w PAD eksperymentalnymi, a w konsekwencji prowadzi do zwiększonej biodostępności NO.
Podsumowując, woda nasycona wodorem poprawia odzyskiwanie perfuzji i zwiększa angiogenezę oraz arteriogenezę poprzez przynajmniej częściową neutralizację ROS w komórkach śródbłonka i makrofagach w warunkach niedokrwienia. Niniejsze badanie może zapoczątkować dalsze badania eksperymentalne i kliniczne, które zweryfikują farmaceutyczne podejście do leczenia PAD.
Tłumaczenie własne Symec Consulting jonizatory.eu na podstawie Hydrogen molecules (H2) improve perfusion recovery via antioxidant effects in experimental peripheral arterial disease, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6236306/
Wszelkie materiały, artykuły (w szczególności depesze, zdjęcia, grafiki, pliki video) zamieszczone na serwisie „jonizatory.eu” chronione są przepisami ustawy z dnia 4 lutego 1994 r. o prawie autorskim i prawach pokrewnych oraz ustawy z dnia 27 lipca 2001 r. o ochronie baz danych. Ich kopiowanie lub modyfikacje będą zgłaszane do odpowiednich służb.
