W ostatnich latach coraz częściej pojawia się choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi (cGVHD) i to właśnie ona jest główną przyczyną śmiertelności pozatransplantacyjnej po allogenetycznym przeszczepie krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT). Badania pokazują, że wodór cząsteczkowy może mieć działanie terapeutyczne na cGVHD.
Aby ustalić, czy wodór może chronić myszy przed cGVHD w modelu przeszczepu mysiego szpiku kostnego (BMT) niezgodnego z MHC, obliczono wskaźniki przeżycia gryzoni, a także oceniono zmiany skórne po BMT. Okazało się, że podawanie soli fizjologicznej bogatej w wodór zwiększyło przeżywalność myszy cGVHD i zmniejszyło również zmiany skórne. Już wcześniej pojawiły się doniesienia o terapeutycznym wpływie wodoru na ostry GVHD, ale nie było informacji o terapeutycznym wpływie wodoru na myszy cGVHD. Sugeruje się, że wodór ma potencjał jako skuteczny i bezpieczny środek terapeutyczny na cGVHD. Badanie przedstawione w tym artykule dostarczyło nowych pomysłów na leczenie cGVHD i pokazało, że wodór cząsteczkowy ma ważne wartości teoretyczne.
Problem z cGVHD
Allogeniczny przeszczep krwiotwórczych komórek macierzystych (allo-HSCT) jest szeroko stosowany w łagodnych i złośliwych chorobach hematologicznych. Spotykamy się z coraz szerszym wykorzystaniem komórek macierzystych krwi obwodowej przy przeszczepie u pacjentów w podeszłym wieku. Jednocześnie poprawia się wczesny wskaźnik przeżycia po transplantacji. Niestety, z roku na rok zwiększa się również częstość występowania cGVHD i to właśnie ona stała się główną przyczyną zgonów niezwiązanych z transplantacją.
Należy podkreślić, że dokładny mechanizm cGVHD jest nadal niejasny. Powszechnie przyjmuje się jednak, że brak równowagi i zwłóknienie czynników zapalnych zajmują dominującą pozycję w rozwoju cGVHD. W 2007 roku Ohsawa i in. odkryli, że wodór ma właściwości przeciwutleniające i antyapoptotyczne. Od tego czasu wodór stał się najczęściej sprawdzanym z gazów medycznych. Ostatnie badania podstawowe i kliniczne wykazały, że wodór może obniżać poziom cytokin, w tym CCL2, IL-1β, IL-6, IL-12, TNF-α itd. W 2011 roku Terasaki i in. wykazali również, że wodór ma działanie przeciwwłóknieniowe. Nieco wcześniej, bo w 2009 roku, wykazano, że wodór może chronić funkcję przeszczepu allogenicznego w modelach przeszczepu jelit, płuc, nerek i serca. W poprzednich artykułach opisaliśmy terapeutyczny wpływ wodoru gazowego na ostrą chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi (aGVHD) po allo-HSCT. Ze względu na działanie przeciwzapalne i przeciwwłóknieniowe postawiliśmy hipotezę, że wodór może mieć działanie terapeutyczne także na cGVHD. W związku z tym zbadaliśmy, czy podawanie soli fizjologicznej bogatej w wodór wywiera działanie terapeutyczne na myszy cGVHD.
Przygotowania do eksperymentu
Podstawą eksperymentu było przygotowanie soli bogatej w wodór. Rozpuszczano go w soli fizjologicznej przez 6 godzin pod wysokim ciśnieniem (0,4 MPa) do poziomu przesyconego przy użyciu aparatury do produkcji wody bogatej w wodór. Nasyconą solankę wodorową przechowywano pod ciśnieniem atmosferycznym w 4°C w aluminiowej torbie bez martwej objętości. Sól fizjologiczna bogata w wodór była świeżo przygotowywana co tydzień, co zapewniało utrzymanie stężenia powyżej 0,6 mM.
Model cGVHD został opracowany zgodnie z opisem Ruzek et al. Śledziony pobrano aseptycznie od myszy B10.D2, a tkankę oddzielono przez wcieranie między sterylne szkiełka z matowego szkła do podłoża RPMI 1640 zawierającego 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS), 1% L-glutaminy i 1% roztworu penicyliny/streptomycyny (pożywka pełna) w celu wytworzenia zawiesiny pojedynczych komórek. Krwinki czerwone poddano lizie przez 1-2-minutową inkubację z roztworem do lizy 150 mM chlorku amonu, żywe komórki zliczono przez wykluczenie błękitu trypanu na hemocytometrze. Przed wstrzyknięciem komórki filtrowano przez 75-μm nylonowy filtr do komórek w celu usunięcia dużych zanieczyszczeń. Między 2 x 107 i 5 x 107 B10.D2 (dla indukcji GVH) śledziony komórki wstrzyknięto dożylnie myszy BALB / c biorcy RAG-2 myszy KO. Gryzonie leczono dootrzewnowo (IP) solą fizjologiczną lub solą fizjologiczną bogatą w wodór (5 ml/kg) codziennie przez 20 dni po przeszczepie.
Weryfikacja stanu zdrowia po przeszczepie
Po leczeniu zwierzęta oceniano co 5 dni pod kątem skórnych objawów cGVHD. Zastosowano następujący system punktacji:
zdrowy wygląd równy 0;
zmiany skórne z łysieniem o powierzchni mniejszej niż 1 cm 2 – 1;
zmiany skórne z łysieniem o powierzchni 1–2 cm 2 – 2;
zmiany skórne z łysieniem większym niż 2 cm 2 w strefie – 3.
Dodatkowo zwierzętom przypisano po 0,3 punktu za choroby skóry (zmiany lub łuszczenie) na uszach, ogonie i łapach. Minimalny wynik to 0, a maksymalny – 3,9.
Ogoloną skórę myszy zatopiono w parafinie, pocięto i barwiono hematoksyliną oraz eozyną. Szkiełka zostały ocenione przez dermatopatologa nieznającego grup eksperymentalnych na podstawie zwłóknienia skóry, utraty tkanki tłuszczowej, stanu zapalnego, zmian powierzchniowych naskórka i wypadania pęcherzyków (0–2 dla każdej kategorii). Minimalny wynik wynosił 0, a maksymalny – 10. Preparaty skórne twardzinowo-skórne wybarwione HE oceniono w 55. dniu po przeszczepie. Zajęcie patologicznego cGVHD skóry było niezależnie oceniane w skali od 0 do 8 dla każdej myszy.
Jak wodór wpłynął na występowanie przewlekłej choroby przeszczepu przeciwko gospodarzowi (cGVHD)?
Przeprowadzono wstępne badania w celu ustalenia, czy wodór może chronić myszy przed cGVHD w modelu mysim. Gryzoniom podawano dootrzewnowo sól fizjologiczną lub sól fizjologiczną bogatą w wodór (5 ml/kg) codziennie przez 20 dni po przeszczepie. 70% myszy cGVHD bez leczenia wodorem umarło do 60. dnia po przeszczepie, podczas gdy 80% myszy poddanej terapii wodorowej przeżyło. Taki wynik każe przypuszczać, że wodór może mieć lecznicze działanie na cGVHD.
W celu określenia terapeutycznego działania wodoru co 5 dni dokonywano skórnej oceny klinicznej, a w 55. dniu po przeszczepie oceniono preparaty skórne twardzinowych zmian skórnych barwionych HE. Zajęcie patologicznego cGVHD skóry było niezależnie oceniane w skali od 0 do 8 dla każdej myszy. Okazało się, że objawy skórne uległy poprawie, a wyniki kliniczne zostały znacznie zmniejszone przez wodór. W 55. dniu po przeszczepie patologiczna punktacja skóry wyniosła 1,6 w grupie wodorowej, a znacznie mniej niż 3,8 w grupie kontrolnej.
Podsumowanie
Chociaż występowanie cGVHD jest coraz częstsze, a do tego jest przeważnie bardzo groźnym powikłaniem po allo-HSCT, wciąż nie ma idealnej metody leczenia tej choroby. Od trzech dekad glikokortykoidy, inhibitory kalcyneuryny (np. takrolimus i cyklosporyna) oraz inne leki immunosupresyjne są nadal głównymi farmaceutykami na cGVHD. Przebieg tej choroby często trwa dużej niż 3 miesiące. Długotrwałe stosowanie glikokortykosteroidów i innych środków immunosupresyjnych często wywołuje poważne skutki uboczne, takie jak ciężka infekcja, wrzód, martwica głowy kości udowej, osteoporoza, przyrost masy ciała, cukrzyca, wysokie ciśnienie krwi, niestabilność emocjonalna itp. Skutki uboczne tych leków są zawsze tak ciężkie, że nie mogą być tolerowane. Jednak wodór nie ma skutków ubocznych i można go bezpiecznie stosować przez długi czas. Należy podkreślić, że wodór jest stale wytwarzany przez bakterie okrężnicy w organizmie i normalnie krąży we krwi. Wdychanie gazowego wodoru nie wpływa na parametry fizjologiczne, takie jak temperatura ciała, ciśnienie krwi, pH i pO 2 we krwi. Wdychanie wodoru przez ludzi jest fizjologicznie bezpieczne. Ta cecha sprawia, że wodór może być używany przez długi czas przy leczeniu cGVHD.
W tym badaniu wykazaliśmy, że leczenie wodorem może zwiększyć przeżywalność myszy cGVHD i poprawić zmiany skórne u gryzoni. Niedawno opisaliśmy przypadek pacjenta z cGVHD skutecznie leczonego wodą bogatą w wodór. Według naszej wiedzy jest to pierwsze badanie wykazujące, że wodór ma działanie terapeutyczne na myszy cGVHD. Mechanizm może opierać się na przeciwzapalnej, przeciwutleniającej i przeciwwłóknieniowej zdolności wodoru. Jednak dokładny mechanizm nadal nie jest jasny. W przyszłości należy go zbadać i do tego również sprawdzić ścieżkę sygnałową zaangażowaną w terapeutyczną rolę wodoru w cGVHD.
Badanie zostało wsparte przez Fundację Innowacyjnej Kultywacji Szpitala Ogólnego Chińskiej Marynarki Wojennej (nr grantu CXPY201603).
Tłumaczenie własne Symec Consulting jonizatory.eu na podstawie Therapeutic effects of hydrogen on chronic graft‐versus‐host disease, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5618705/
Wszelkie materiały, artykuły (w szczególności depesze, zdjęcia, grafiki, pliki video) zamieszczone na serwisie „jonizatory.eu” chronione są przepisami ustawy z dnia 4 lutego 1994 r. o prawie autorskim i prawach pokrewnych oraz ustawy z dnia 27 lipca 2001 r. o ochronie baz danych. Ich kopiowanie lub modyfikacje będą zgłaszane do odpowiednich służb.
